由于本病目前属于少发性性病，诊断软下疳应特别慎重。必要的实验室检查是诊断软下疳的关键。最简单的实验方法是革兰氏染色涂片。有条件的应作细菌培养和组织病理检查。

　　１、涂片检查

　　从溃疡处取材作涂片时，由于脓性分泌物中的杂菌易使结果混淆，故应先将溃疡清洗干净，涂片可用革兰氏染色或姬姆萨染色。杜克雷菌在涂片中为短小(2μm)的呈平行直线排列的二极染色菌，革兰氏染色阴性。如果有典型的症状，实验室又能查到杜克雷菌，本病即可诊断。

　　２、细菌培养

　　常用的培养基有淋球菌胎牛血清琼脂、巧克力马血琼脂，取标本时应将溃疡表面的痂皮和碎屑去掉，用灭菌拭子采取分泌物和溃疡的基底部物质。将标本接种于平皿上，划线分离。平皿放入5%～10%二氧化碳和饱和湿度的环境中，于33℃～35℃至少培养48小时看结果。杜克雷菌的菌落较小，如针尖大小，光滑，呈半球形。但菌落常呈不同的形状，可呈半透明状、浅灰色和肤黄色等。菌落的特点是紧密，如用接种环触之，几乎整个菌落在培养基上滑动。

　　对培养出的菌落可用氧化酶试验、硝酸盐还原试验、对辅酶Ⅰ和氯化血红素等试验，根据不同需要加以鉴定；也可用过氧化氢酶、吲哚、尿素酶、糖的利用试验等加以鉴定。对菌珠进行鉴定是诊断软下疳所必需的。有些不具备条件的实验室，一发现有细菌生长即诊断本病，是不科学的。

　　３、组织病理检查

　　对软下疳患者进行必要的组织病理检查有助于对本病的诊断。组织病理显示3个带，上层为溃疡底部，较狭窄，可见嗜中性白细胞、纤维蛋白、坏死组织及革兰氏阴性杆菌；中层颇宽，含多数新生血管，血管内皮细胞增生，血管腔闭锁，血栓形成；下层在真皮深部，为致密的浆细胞和淋巴细胞浸润。